實驗方法:
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
細胞簡介：
人膀胱成纖維細胞分離自膀胱組織；膀胱是一個儲尿器官，在哺乳類動物，它是由平滑肌組成的一個囊形結(jié)構(gòu)，位于骨盆內(nèi)，其后端開口與尿道相通。膀胱與尿道的交界處有括約肌，可以控制尿液的排出。膀胱壁由三層組織組成，由內(nèi)向外為黏膜層、肌層和外膜。肌層由平滑肌纖維構(gòu)成，稱為逼尿肌，逼尿肌收縮，可使膀胱內(nèi)壓升高，壓迫尿液由尿道排出。在膀胱與尿道交界處有較厚的環(huán)形肌，形成尿道內(nèi)括約肌。在括約肌收縮能關閉尿道內(nèi)口，防止尿液自膀胱漏出。膀胱壁分為三層：即漿膜層（蜂窩脂肪組織）、肌肉層（逼尿肌、膀胱三角區(qū)?。┖宛つ樱O薄的一層移行上皮組織）。成纖維細胞（Fibroblast）是疏松結(jié)締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來。成纖維細胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細胞功能活動旺盛，細胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細胞對不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損的修復有著十分重要的作用。剛分離的膀胱成纖維細胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細胞基本貼壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團；細胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細胞質(zhì)透明，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。膀胱成纖維細胞分泌的生長因子是一種具有多功能的促有絲分裂原，研究已表明其參與惡性腫瘤的形成過程。近年來，堿性成纖維細胞生長因子在膀胱癌發(fā)病過程中的作用、與生物學行為之間的關系以及上的應用已受到重視。
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組織來源 |
產(chǎn)品規(guī)格 |
貨號 |
用途 |
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膀胱組織 |
5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 |
A01X1336 |
僅供科研研究實驗 |
培養(yǎng)信息：
培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長特性 貼壁
細胞形態(tài) 成纖維細胞樣
傳代特性 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳
消化液 0.25%胰蛋白酶
培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%
方法簡介：
公司實驗室分離的人膀胱成纖維細胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：
公司實驗室分離的人膀胱成纖維細胞經(jīng)Vimentin熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。
公司正在出售的產(chǎn)品：
17-OHPELISAKit
大鼠多巴胺(DA)elisa分析檢測試劑盒
DA ELISA Kit
山羊雌(E)elisa分析檢測試劑盒
EELISAKit
豚鼠球蛋白A(IgA)elisa檢測試劑盒
氨肽酶N（aminopeptidase
N）
組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DDPH）定量檢測試劑盒
腺苷脫氨酶ADA測試盒酶比色法 96T 微板法
巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)elisa分析檢測試劑盒
M-CSF ELISA Kit
人蛋白聚糖4(PRG4)elisa分析檢測試劑盒
HumanPRG4ELISAKit
餅干麥芽糖含量酶連續(xù)反應光譜法定量檢測試劑盒
小鼠L-型電壓依賴鈣離子通道α1F亞基(CACNα1F)elisa檢測試劑盒
大鼠血小板膜糖蛋白IIb(GPIIb)elisa檢測試劑盒
細胞CASPASE-10蛋白表達比色法定量檢測試劑盒
鈣粘蛋白相關家庭成員5/μ-protocadherin抗體
MUPCDH
FAM205A蛋白抗體
FAM205A
甲狀腺受體β抗體(THβ1，THβ2) Anti-THRB1/Thyroid Hormone Receptor beta
ras癌基因家族RAB8B抗體 Anti-RAB8B
神經(jīng)肽Y1受體抗體 Anti-NPY1R
超氧化物歧化酶2抗體 Anti-SOD2
APC標記的兔抗羊IgM
人膀胱成纖維細胞Rabbit Anti-Goat IgM / APC
胚胎外精子源蛋白1抗體
CD 288; CD288; CD288
antigen; MGC119599; MGC119600; TLR 8; TLR-8; Tlr8; TLR8_HUMAN; Toll Like
Receptor 8; Toll-like receptor 8.
人膀胱平滑肌細胞
小鼠前脂肪細胞
LX-2人肝星形細胞
CHO-K1（倉鼠卵巢細胞亞株）
實驗具體步驟：
（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；
（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉(zhuǎn)移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養(yǎng)皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯(lián)合消化組織3-5 min，
利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結(jié)締組織等）
（6）種植組織塊：將上述組織使用2X雙抗冰冷PBS洗滌3次，每次5min，然后使用完全培養(yǎng)基（含有1X雙抗）洗滌一次。經(jīng)過的心臟破碎組織塊經(jīng)過離心后，可以用細頭
鑷子將組織塊種植于培養(yǎng)皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養(yǎng)皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養(yǎng)皿正置3-5小時，然后更換培養(yǎng)皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養(yǎng)皿在4℃正置過夜）；
（7）培養(yǎng)基培養(yǎng)：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養(yǎng)基，然后在恒溫潮濕細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；
（8）貼壁細胞傳代：當單個細胞從組織塊爬出面積在組織塊3-5倍，進行傳代，此時可以使用0.25% or 1/3 0.25% 胰蛋白酶消化組織塊爬出的細胞，消化時間根據(jù)正常細胞消化時間即可，當然可以在消化過程中不斷管擦爬出細胞的皺縮情況，一旦達到消化完成（皺縮細胞≥70%）即可使用完全培養(yǎng)基終止消化。在吹打單個細胞時候，一定要輕柔/緩慢，不能吹打到組織塊，如果組織塊掉下來，大概率是不會再貼壁成功啦。根據(jù)細胞數(shù)量種植到對應的培養(yǎng)皿/瓶中；
（9）鑒定：細胞在傳代至代、第五代、第十代時候可以將部分細胞進行鑒定，鑒定辦法包括：RNA-seq、western blot、qRT-PCR、RT-PCR、IF、流式細胞術(shù)等。